System drożdżowy do przeszukiwania inhibitorów głównej proteazy SARS-CoV-2 wykorzystuje w swych badaniach dr Andonis Karachitos z Wydziału Biologii UAM.
Gdy wirus SARS-CoV-2 wniknie do komórki gospodarza, rozpoczyna się synteza długich łańcuchów poliprotein, które muszą ulec przecięciu, między innymi z udziałem głównej proteazy (Mpro). W ten sposób powstaje kilkanaście białek niestrukturalnych niezbędnych dla funkcjonowania wirusa. Dzisiaj wiemy, że jeżeli zablokujemy działanie Mpro, dojdzie do zahamowania replikacji wirusa. Wielu badaczy aktualnie poszukuje skutecznych inhibitorów Mpro, które mogłyby pomóc w leczeniu zakażeń wirusem SARS-CoV-2.
Mpro jest białkiem enzymatycznym. W strukturze białka niewielki jego obszar zwany miejscem aktywnym odpowiedzialny jest za aktywność proteolityczną (hydroliza białek w miejscu rozpoznanym przez enzym). Zablokowanie miejsca aktywnego z pewnością zakłóciłoby działanie Mpro, natomiast my chcemy uderzyć w Mpro z innej strony i zaburzyć jego czwartorzędową strukturę. Wiemy, że Mpro występuje w formie homodimeru, czyli musi najpierw stworzyć parę z drugim, identycznym polipeptydem Mpro, aby być aktywnym enzymem. Celem naszego projektu jest znalezienie substancji blokującej odziaływanie między parą Mpro – Mpro, ponieważ wiemy, że spowoduje to zahamowanie replikacji wirusa.
Do realizacji naszego planu badawczego wykorzystamy genetycznie zmodyfikowane drożdże Saccharomyces cerevisiae, w których zajdzie ekspresja genu kodującego białko wirusowe Mpro. System drożdżowy będzie zaprojektowany w taki sposób, że gdy wytworzy się para Mpro – Mpro, będziemy mogli zaobserwować wyraźną zmianę barwy kolonii. Jeśli więc zakłócimy dimeryzację, czyli oddziaływanie Mpro – Mpro, dojdzie do utraty tej barwy. Chcielibyśmy stworzyć pewnego rodzaju test biologiczny, oparty na wcześniej opracowanym drożdżowym systemie dwuhybrydowym, który jest niezwykle czułą metodą pozwalającą na badanie oddziaływań białko-białko. Dodatkowo, nasze komórki drożdży zostaną pozbawione kluczowych genów warunkujących wielolekooporność, dzięki czemu nie będzie dochodziło do aktywnego usuwania leków z komórki.
Skonstruowany w ten sposób system pozwoli na wykonanie bardzo szybkich badań przesiewowych w kierunku znalezienia skutecznego czynnika zaburzającego dimeryzację Mpro. Wykorzystamy do tego specjalne biblioteki zawierające kilka tysięcy związków chemicznych, w tym zatwierdzonych leków, a także ekstrakty z roślin i grzybów. Nie wykluczamy również zastosowania dwóch lub większej liczby leków jednocześnie w celu identyfikacji silniejszego działania (synergizmu) leków w przypadku ich łączenia. Liczymy na to, że uda nam się znaleźć choćby jedną substancję, która będzie skutecznie blokować dimeryzację Mpro.
Ostatnim etapem badań będzie sprawdzenie, czy znaleziony przez nas kandydat jest rzeczywiście inhibitorem Mpro, hamującym jej aktywność proteolityczną. W tym celu wykorzystamy inny system drożdżowy, w którym doprowadzimy do fuzji białka Mpro oraz białka zielonej fluorescencji (GFP). Cała sztuczka w tej metodzie będzie polegała na tym, że w komórkach powstanie białko fuzyjne GFP-Mpro, a pomiędzy nimi będzie znajdowała się krótka sekwencja aminokwasowa, rozpoznawana i przecinana przez Mpro. Normalnie, w takim przypadku Mpro będzie autokatalitycznie odcinała fuzyjne białko GFP, czyli zarówno Mpro, jak i GFP będą występowały w komórce niezależnie. Zahamowanie aktywności katalitycznej Mpro przez skuteczny inhibitor nie pozwoli na odcięcie GFP od Mpro, a więc zmusi białko fuzyjne GFP-Mpro do pozostania w formie dłuższej, o większej masie. To czy białko GFP-Mpro występuje w formie przeciętej lub niezmienionej, będzie można w łatwy sposób zweryfikować.
Na koniec muszę podkreślić, że nie jestem wirusologiem i nie zajmowałem się wcześniej tego typu problematyką badawczą. Od lat tworzę różne modele drożdżowe, szczególnie w badaniach nad mechanizmami ludzkich chorób, poprzez manipulacje genetyczne i odtwarzanie funkcji ludzkich białek w komórkach drożdży (tzw. humanizowanie drożdży). Chciałbym wykorzystać całe swoje doświadczenie badawcze, skoncentrować wszystkie siły, aby dołączyć do ciągle trwającej walki z pandemią COVID-19. Jestem pełen optymizmu, bo w zespole badawczym mam zdolnych i gotowych do działania ludzi. W skład zespołu wchodzą: dr Ewa Kosicka, doktoranci Martyna Baranek i Wojciech Grabiński oraz studentki biotechnologii Ewelina Hejenkowska, Joanna Budzik i Paulina Śliska. Wierzę, że uda się nam wspólnie osiągnąć założone cele.
zob. też
